Western blot

Western Blot (synonyma: Enzyme-linked Immunoelectrotransfer Blot Technique, v české literatuře též označovaný jako imunoblot ^[zdroj?]) je technika na bázi elektroforézy a enzymatické reakce, hojně využívaná v imunologii, molekulární biologii a medicíně k detekci specifických protilátek. Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám jako je ELISA, je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale za to přesnější (větší specifičnost).

[editovat] Metodika Western Blotu

• 1. fáze: SDS-PAGE
  

První část se skládá z klasické SDS-PAGE elektroforézy, kdy je antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli dle molekulární hmotnosti proteinů antigenu. Na gelu se vytvoří tzv. bandy (z angl. proužky, pásky). Gel se poté vyjme z elektroforetické vaničky a pomocných sklíček.

• 2. fáze: blotování
  

Gel z elektroforézy se následně přiloží na PVDF membránu a na blotovacím zařízení poté působením elektrického proudu dojde k přeblotování proteinů z gelu do PVDF membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu.

• 3. fáze: vyvíjení (stejné jako ELISA)

Membrána se nastříhá na potřebný počet proužků, přičemž každý proužek s proteiny nechá inkubovat ve vaničkách s testovaným sérem (protilátkami). Po promytí proužků se přidává konjugát (neboli protilátky proti druhově specifickým protilátkám značené enzymem). Po inkubaci s konjugátem a promytí se přidá substrát. „bandy“, na něž se navázaly specifické protilátky se obarví (viz obrázek SDS-PAGE).

[editovat] Výhody Western Blotu oproti jiným sérologickým metodám

Princip spočívá v tom, že každý infekční agens má svůj specifický antigen proti němuž vznikají zcela specifické protilátky. Příbuzné druhy baktérií či virů mají řadu podobných antigenů či sdílejí stejné epitopy (konkrétní místo antigenu, kam se váží protilátky). To se v praxi projeví tím, že u běžných sérologických metod vznikají zkřížené reakce. To znamená, že třeba antigen jednoho druhu viru (patogenní) může reagovat s protilátkami proti zcela nepatogennímu viru, což vede k chybné diagnostice onemocnění. Je-li znám konkrétní protein („band“) který je specifický pro daný druh viru, baktérie či parazita, je možné právě metodou Western Blotu tento specifický protein detekovat a vyloučit tak jiné příbuzné druhy patogenů.

[editovat] Použitá literatura

• Ferenčík M., Škárka B., a kol. Biochemické laboratórne metódy. Vydavateľstvo technickej a ekonomickej literatúry, Bratislava, 1984.
• Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Elsevier, Amsterdam, 1985.
• Tizard I.R. Veterinary Immunology - an introduction. Saunders co., Philadelphia, 1996.
• Toman M. a kol. Veterinární imunologie. Grada Publishing, Praha, 2000.